Este extracto de ARN consiste en una mezcla del material genético de la persona y, de estar presente, del ARN del coronavirus.
Se procede a la transcripción inversa del ARNm para convertirlo en ADN monocatenario mediante una enzima específica llamada transcriptasa inversa (M-MLV). Para llevar acabo este proceso, se añaden pequeños fragmentos adicionales de ADN que complementan determinadas partes del ARN vírico transcrito. Esos fragmentos llamados oligos dT se adhieren a partes específicas del ARN vírico (colas de adenina o también llamadas colas poliA) que sirven para crear la cadena de ADNc ya que la enzima M-MLV reconoce el sitio de union donde empezará la síntesis de dirección 3' a 5'.
La sintesís del ADNc apartir del ARN del virus se duplica de manera exponencial
A continuación, se introduce esa combinación en un aparato de RT-PCR, donde se someten a ciclos de calor-frío para provocar determinadas reacciones químicas que dan lugar a nuevas copias idénticas de partes específicas del ADN vírico. Esos ciclos se repiten una y otra vez para seguir copiando las partes específicas del ARN vírico. En cada uno de ellos se duplican las cantidades: de dos copias, se pasan a cuatro; de cuatro, a ocho, y así sucesivamente.
qPCR.
La qPCR o también llamdo reacción en cadena de la polimerasa es una técnica que permite obtener
múltiples copias de una molécula de DNA mediante la amplificación enzimática de una
secuencia de DNA templado (DNAc). La secuencia a amplificar es delimitada por un par de
oligonucleótidos que hibridan con cada una de las cadenas de polinucleótidos de la doble
hélice.
La amplificación generalmente se lleva a cabo empleando la enzima DNA
polimerasa I (Taq) de Thermus aquaticus.
Una reacción de PCR contiene: 1. el DNA blanco, 2. una pareja de oligonucleótidos, 3. desoxinucleótidos trifosfato, 4. cloruro de magnesio y 5. Buffer [Tris-HCl (pH 8.4) y KCl] y la Taq
DNA polimerasa.
La reacción comienza al calentar la mezcla de reacción a 94°C, a esta
temperatura los puentes de hidrógeno que mantienen unidas a las dos cadenas de
polinucleótidos de la doble hélice se rompen, desnaturalizando al DNA en moléculas de
cadena sencilla. Posteriormente, se baja la temperatura a 50-60°C, lo cual permite una
cierta re-naturalización de las hebras de DNA y del apareamiento de los oligonucleótidos
con su secuencia complementaria. La síntesis de DNA se lleva a cabo a 72°C. El ciclo de
desnaturalización-alineamiento-extensión se repite aproximadamente 30 ciclos,
obteniendo microgramos de un producto de PCR a partir de unos cuantos nanogramos de
DNA templado.
